Si alguna vez has realizado una sopa de letras, sabes que puede ser difícil encontrar una pequeña secuencia de letras entre muchas otras. Una sopa de letras promedio contiene alrededor de 400 letras y es muy variada, con todas las letras del alfabeto, pero buscar una secuencia específica en el genoma es mucho, mucho más difícil.

Las cuatro bases de ADN son Adenina(A), Citosina (C), Guanina (G), y Timina (T). Estas bases siempre son pareadas siempre de la misma forma A se empareja con T y C con G. Haz clic en la imagen para aumentar el tamaño.

En la búsqueda del genoma humano, se obtienen secuencias cortas utilizando combinaciones de solo cuatro letras (A, C, G y T). Estas letras representan las cuatro bases de nucleótidos para el ADN (adenina, citosina, guanina y timina). Si se busca una secuencia específica-por ejemplo, ACTGTATGT- en un acertijo con tres billones de letras de largo, sería equivalente a un acertijo 750,000 veces más largo que una sopa de letras común, con letras en dos largas líneas. Entonces, ¿Cómo es que CRISPR trabaja para encontrar y modificar algo tan específico en un acertijo tan largo?

Anatomía de CRISPR

Revisemos algunos conceptos base rápidamente antes de entrar en detalles. Hay muchas variedades de herramientas CRISPR utilizadas en la edición de genes. Sin embargo, la más común es llamada CRISPR Cas9. CRISPR Cas 9 se nombró debido a la enzima específica asociada (Cas) que corta ADN. Otras herramientas CRISPR utilizan otras enzimas Cas, como Cas3 o Cas10, pero por ahora, nos enfocaremos en Cas9 como ejemplo.

La herramienta de edición de CRISPR Cas9 contiene dos partes principales, una más larga que la otra. La parte más larga es la enzima Cas9, que corta el ADN en un sitio particular. La parte más corta es una secuencia corta de ácidos nucleicos llamados ARN guía(gARN). El gARN ayuda al sistema CRISPR a identificar su sitio particular de ADN coincidente. Estas partes funcionan en dos pasos: buscar (encontrar) y cortar. 

Buscar y cortar

Se puede pensar en CRISPR buscando secuencias específicas de ADN como se buscan palabras en la computadora. Esta imagen muestra la búsqueda de la palabra “target” en el párrafo de la derecha (“First, CRISPR…”). 

Primero, CRISPR busca una secuencia específica de ADN como sitio destino. La función de buscar de CRISPR es como la función Buscar en la computadora. Puedes probarlo por tu cuenta en esta página. Si utilizas una PC, presiona y mantén presionados las teclas Control y F para abrir el cuadro de búsqueda. Si estás utilizando una Mac, presiona y mantén presionado Control y F). Ahora escribe destino. Observa cómo la pantalla marca cada lugar de la página que coincide con lo que escribiste y es más fácil de encontrar.

El gARN es como una palabra que escribes en el buscador. Este ayuda a CRISPR a encontrar aquellos lugares en el genoma que concuerdan con el gARN. Científicos diseñan gARN para complementar secuencias bases del ADN en el sitio que se desea cortar. La secuencia complementaria permite al sistema CRISPR unirse libremente al ADN en la ubicación seleccionada. 

En esta ilustración, el ARN es la hebra amarilla con un pliegue en forma de horquilla. Una cola de ARN encuentra el punto exacto para cortar el ADN. Este sistema CRISPR Cas9 ha sido utilizado para modificar genes en peces cebra.

Una vez el gARN ha localizado el sitio objetivo, la enzima Cas9 corta el ADN en ese sitio del genoma como unas tijeras. Cas9 corta a través del ADN, cortándolo en dos. Juntos, el gARN y la enzima Cas9 permiten a los científicos cortar en localidades muy específicas el ADN del genoma de una célula. 

Cuando hay algún quiebre en el ADN de una célula, la célula puede sentir que ese ADN ha sido dañado. En respuesta, la célula tratará de reparar ese daño en el ADN al unir las dos piezas de nuevo. La edición de genes toma ventaja de este proceso de reparación natural a científicos y científicas para crear sus propios cambios intencionales a un genoma.

Afuera lo viejo

Cuando una célula intenta reparar ADN roto, la reparación puede darse en dos formas. La primera y más común es llamada unión de extremos no homóloga (o unión de extremos). Aquí, las células intentan volver a unir los cortes extremos de dos piezas de ADN. Esto a veces es exitoso, y si no se añaden o se eliminan bases, el ADN reparado es exactamente igual al que era antes del corte. Este proceso no siempre es perfecto y puede haber errores durante la reparación.  

La unión de extremos puede ocurrir cuando un corte ha sido producido en el ADN. Usualmente, esto corrige cualquier ruptura del ADN, sin alterarlo. Pero esta forma de reparar el ADN es útil para algunos científicos y científicas, ya que se puede cortar en dos ubicaciones que rodean un gen, para eliminarlo o hacer que se reconecte. Los y las científicas también pueden crear puntos para agregar ADN, conociendo que el ADN se reconectará si los extremos del nuevo ADN son similares a los anteriores. 

Algunas veces nuevas bases de nucleótidos son añadidas donde hubo cortes o eliminación de bases de los extremos de ADN durante la reparación. El resultado es una secuencia de ADN que puede ser diferente a donde se realizó el corte. La diferencia en la secuencia de bases puede generar que un gen pare de funcionar. La unión final generalmente da como resultado la disfunción del gel. Esto permite a los científicos estudiar qué hacen los genes al comparar comportamiento celular antes y después de la edición hasta la unión final. 

Adentro lo nuevo

La segunda forma que una célula puede reparar la ruptura de ADN es mediante la reparación homóloga directa (la llamaremos reparación directa). Esta forma permite agregar nuevas bases o genes completos a un genoma. Es capaz también de reemplazar bases o genes existentes a través del uso de plantillas donantes de ADN. Las plantillas son secuencias cortas y lineares de ADN diseñadas por científicos y científicas para indicar a las células cómo ésta debe reparar el sitio de corte. Las plantillas donadoras tienen tres secciones principales. 

En la reparación dirigida, una plantilla de ADN es introducida de tal forma que sus extremos se alinean con los bordes de ADN fragmentados. Haga clic para más detalles.

En medio de la plantilla de ADN se encuentra la secuencia de bases o el gen a ser editado en el genoma. A los lados de esta secuencia se encuentran secuencias mucho más largas llamadas brazos homólogos. Cada uno de estos brazos coincide exactamente con las secuencias de ADN de los lados de el sitio de corte original. 

Normalmente, cuando una célula intenta reparar una ruptura en su ADN, se fija en las secuencias de ADN cercanas al sitio de corte para guiarse dónde deberá unirse el ADN de nuevo. En la reparación dirigida, la plantilla donante es similar a la secuencia original alrededor del sitio de corte, excepto por una nueva secuencia de nucleótidos o genes por ser añadidos. Entonces, cuando la célula busca guía para la reparación de ADN, utiliza la plantilla. Como resultado, esta secuencia insertada es copiada a la célula en reparación.